一、模型概述

　　1. 設(shè)計腦膠質(zhì)瘤動物模型原則:

　　①腫瘤須起源于腦膠質(zhì)細胞;

　?、谀[瘤細胞能在體外或體內(nèi)正常生長和增殖;

　　③腫瘤生長狀況可評估;

　?、苣Ｐ湍[瘤應(yīng)具有與人腦膠質(zhì)瘤相似的生物學(xué)特征，如浸潤性生長、異常血管生成、血－腦屏障通透性的改變等;

　?、莺闪鍪笊嫫趹?yīng)盡可能長，以用于檢驗和治療;

　?、弈[瘤細胞對同源宿主的免疫排斥低;

　?、吣[瘤細胞無皮下或硬膜外腔轉(zhuǎn)移;

　　⑧模型對治療手段的反應(yīng)可模擬臨床工作中人腦膠質(zhì)瘤的治療過程。

　　2. 受體動物選擇

　?、?嚙齒類動物

　　建立腦膠質(zhì)瘤移植瘤動物模型最常用的受體動物為雄性大、小 鼠類等。

　　研究表明雌激素及孕激素某種程度上對腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生有抑制作用，因此應(yīng)使用雄鼠構(gòu)建動物模型。常用的大鼠有 SD 大鼠、Wistar大鼠、Fischer344大鼠等，小鼠有 BALB /C 小鼠、昆明小鼠、C57小鼠及裸鼠等。

　　② 其他動物

　　斑馬魚模型在癌癥研究方面取得了顯著的進展，這些研究的一個重要基礎(chǔ)是斑馬魚模型和人類腫瘤中的分子通路具有高度的相似性和保守性。

　　斑馬魚模型的一個嚴重缺陷是，腦膠質(zhì)瘤處于 32℃的環(huán)境中，可能會對新陳代謝和致癌分子通路的活性產(chǎn)生影響。

　　現(xiàn)階段，如豬、犬等，也被用作腦膠質(zhì)瘤實驗動物模型的受體動物。

　　3. 模型的構(gòu)建

　?、?種植位置選擇

　　異位移植瘤模型多通過在動物皮下注射腦膠質(zhì)瘤細胞懸液，然后用卡尺測量腫瘤體積變化以觀察腫瘤生長情況。由于接種位置與中樞神經(jīng)系統(tǒng)在微環(huán)境上存在明顯差異，且機體強烈的免疫排斥導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生自愈傾向，使模型穩(wěn)定性欠佳，限制了異位移植瘤模型的應(yīng)用。

　　② 原位移植瘤手術(shù)方法與要點

　?、俨捎眉羲槟[瘤組織塊，然后用針管將其植入到動物顱內(nèi)的方法，這種方法雖然操作簡單，但難以保證定位的精確性及操作的穩(wěn)定性，成功率低，且難以定量研究。

　?、诶昧Ⅲw定向技術(shù)將經(jīng)過培養(yǎng)的、標(biāo)準(zhǔn)定量的腫瘤細胞接種到鼠腦中。使用立體定向儀，成瘤率明顯提高。用此法可使腦膠質(zhì)瘤細胞能定位、定量地注入目標(biāo)位置，防止針頭誤入側(cè)腦室，減少顱外生長，從而使構(gòu)建的模型更為可靠。

　　二、誘導(dǎo)模型

　　根據(jù)誘導(dǎo)劑的不同，腦膠質(zhì)瘤動物模型又主要分為化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)和病毒誘發(fā)型。

　　化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的腦膠質(zhì)瘤動物模型

　　首見是利用甲基膽蒽制成丸劑植入小鼠腦內(nèi)而成功誘發(fā)的腦膠質(zhì)瘤。隨后,又出現(xiàn)了新的致瘤物質(zhì)，如烷化劑, 尤其是甲基亞硝基脲和乙基亞硝基脲在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有很高的腫瘤誘發(fā)率。

　　研究表明由乙基亞硝基脲誘發(fā)的Fisher大鼠腦膠質(zhì)瘤模型, 聯(lián)合影像學(xué)的應(yīng)用, 是實驗室模擬治療低級膠質(zhì)瘤的有效方法。

　　化學(xué)物質(zhì)誘發(fā)的膠質(zhì)瘤模型病程與人類膠質(zhì)瘤較為相似, 可被用于膠質(zhì)瘤的移植試驗等, 但也存在誘發(fā)腫瘤的遺傳背景不清楚、種類不一、性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點。

　　病毒誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的可能機制有兩個：

　?、偈遣《就ㄟ^將其基因組整合至宿主細胞基因組, 導(dǎo)致宿主腫瘤相關(guān)基因的激活或抑癌基因的失活。

　?、谑怯行┎《净騼?nèi)含有致癌基因, 其編碼的蛋白可促使宿主細胞發(fā)生癌變。

　　目前應(yīng)用于誘發(fā)腦膠質(zhì)瘤動物模型的病毒有 BKV、JCV 和 RSV等。

　　病毒誘發(fā)模型是用于研究膠質(zhì)瘤放/化療效果的較好模型；但由于該膠質(zhì)瘤模型動物表達某些病毒性腫瘤特異性抗原, 在研究膠質(zhì)瘤免疫療法時, 表現(xiàn)出很強的免疫原性, 因此，在實際應(yīng)用中并不常用。

　　三、移植模型

　　移植性動物模型是目前應(yīng)用最多的腫瘤模型, 也是膠質(zhì)瘤動物模型中使用最多的方法。

　　移植性腫瘤動物模型可分為異種移植和同種移植模型：

　　1. 異種移植模型

　　為了更好地模擬人腦膠質(zhì)瘤的特性，異種移植瘤模型常用原代人源腦膠質(zhì)瘤細胞、腦膠質(zhì)瘤干細胞( glioma stem cell，GSC) 和腦膠質(zhì)瘤組織。常用的細胞系包括人腦膠質(zhì)瘤細胞系 U87、U251、LN229、T98G、U373 等。

　　如人類膠質(zhì)瘤細胞系 U251 皮下或顱內(nèi)注射的裸鼠模型, 可模擬人類膠質(zhì)瘤的典型性特征, 在組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)方面與人類膠質(zhì)母細胞瘤極為相似; 人類膠質(zhì)瘤細胞系 U87 顱內(nèi)注射的裸鼠模型雖然與人類膠質(zhì)瘤不太相似, 但卻是用于研究抗腫瘤血管生成及膠質(zhì)瘤高復(fù)發(fā)率的良好模型。

　　2. 同種移植模型

　　同種移植動物模型的特點是腫瘤組織或細胞移植發(fā)生在同種或同系動物之間。同種移植瘤模型常用的細胞系包括大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞系 C6、9L和小鼠腦膠質(zhì)瘤細胞系GL261、G422等

　　小鼠膠質(zhì)瘤細胞系 GL261顱內(nèi)注射正常小鼠模型; 大鼠膠質(zhì)瘤細胞系 C6 接種于 Long–Evans大鼠模型; 大鼠膠質(zhì)瘤細胞系 9L 腦紋狀體注射Wistar大鼠模型。

　　這類模型具有以下性質(zhì):

　　①在顱內(nèi)形成的移植瘤能較好地模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的微環(huán)境;

　?、谏L在腦內(nèi)的移植瘤能夠在種植位置局部以浸潤方式生長，與人腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為相對一致。過去原位移植瘤模型存在操作復(fù)雜、難以觀察腫瘤生長情況等缺陷，但隨著立體定向注射技術(shù)和影像診斷技術(shù)的進步，原位移植瘤模型有了更加廣泛的應(yīng)用空間。

　　四、轉(zhuǎn)基因模型

　　小鼠是最主要的轉(zhuǎn)基因模式動物, 被廣泛的應(yīng)用于生物科學(xué)和醫(yī)藥研究中。目前采用的方法主要有兩大類：

　　（1）傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠類型；

　　（2）病毒載體介導(dǎo)類型。

　　很多人類腫瘤的發(fā)生通常伴隨著癌基因的激活和抑癌基因的突變或缺失, 膠質(zhì)瘤的發(fā)生也不例外。

　　1. 傳統(tǒng)的基因工程小鼠腫瘤模型

　　在受精卵和胚胎干細胞水平進行基因?qū)牖蚯贸梢越鹘y(tǒng)基因工程小鼠模型。但是，成人腦膠質(zhì)瘤主要是后天在環(huán)境因素的影響下發(fā)病，而傳統(tǒng)的基因工程小鼠模型是在其胚胎發(fā)育期人為更改腫瘤發(fā)生基因或腫瘤抑制基因的表達水平，其腫瘤的發(fā)生時間比人類腦膠質(zhì)瘤的好發(fā)年齡早。

　　此外，由于基因敲除小鼠的所有體細胞基因組上都存在靶基因的缺失或突變，有些基因敲除后動物難以成活，無法進行后續(xù)研究。因此，目前已基本不采用此模型。

　　2. 病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型

　　根據(jù)使用載體的不同又可分為腺病毒介導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)和慢病毒介導(dǎo)膠質(zhì)瘤模型。

　　三種載體各有其優(yōu)缺點：

　　腺病毒載體具有高效傳遞和表達基因的能力, 但腺病毒自身具有的非特異致瘤性限制了其應(yīng)用;

　　逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組能穩(wěn)定地整合至宿主基因組中, 但其宿主范圍較窄, 只能感染分裂細胞;

　　慢病毒載體是目前應(yīng)用前景較好的轉(zhuǎn)基因載體, 該載體不僅能將外源基因有效地整合到靶細胞基因組內(nèi), 而且可以感染各種非分裂細胞。

　五、模型評價

　　1、動物行為學(xué)評價

　　觀察動物表現(xiàn)既往采用觀察癥狀、體征的方法對動物模型的腫瘤生長情況進行評估，如進食情況、體重、精神狀態(tài)以及壓迫癥狀( 顱內(nèi)壓增高表現(xiàn)、偏癱) 等。

　　2、組織學(xué)檢查

　　瘤體形態(tài)欠規(guī)則，無包膜，向周圍浸潤生長，切面色白，呈魚肉狀。

　　3、病理染色

　　HE染色后鏡下觀察，可見腫瘤區(qū)較正常腦組織染色深，有較明確的邊界。腫瘤細胞豐富、密集，常排列呈束狀及小團塊狀，細胞分化差，胞核大、圓、深染，核分裂象多見。

　　腫塊內(nèi)部血管豐富，常見柵欄狀壞死區(qū)，瘤周組織可有水腫。Ki-67染色結(jié)果可反映腫瘤細胞的增殖能力。

　　4、小動物活體成像檢查

　　活體成像發(fā)光技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤體內(nèi)實驗。

　　該技術(shù)是讓腫瘤細胞帶上熒光素酶( Luciferase)或綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽，然后用小動物活體成像儀檢測腫瘤的生物發(fā)光或熒光，以直觀可視地、動態(tài)地觀察腫瘤生長，檢測腫瘤生長情況以評估腫瘤大小。

　　5、影像學(xué)檢查

　　磁共振成像( MＲI) 技術(shù)的應(yīng)用為動物成瘤過程的檢測提供了新的途徑。

　　它作為一種無創(chuàng)性的影像學(xué)檢測方法，可以在不處死動物的情況下對腫瘤的生長情況進行動態(tài)的、多方位的觀察，便于在適當(dāng)?shù)臅r間進行藥效學(xué)研究。