想驗(yàn)證miRNA與靶基因的作用? ——雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

想了解miRNA和lncRNA/circRNA的靶向互作?——雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

想知道轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游基因的作用? ——雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

沒錯(cuò)，雙螢光素酶體系就是這么的強(qiáng)大!

雙熒光素酶報(bào)告基因通常以螢火蟲熒光素酶為報(bào)告基因，以海腎熒光素酶為內(nèi)參基因。所構(gòu)成的報(bào)告系統(tǒng)具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍廣、應(yīng)用靈活等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于基因調(diào)控、非編碼RNA靶向互作等研究領(lǐng)域。今天，我們就來重點(diǎn)聊聊這個(gè)話題。

雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)的原理

將目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件構(gòu)建入帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達(dá)載體，構(gòu)建成報(bào)告基因質(zhì)粒，使這段序列調(diào)控luciferase的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。然后將報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，給予其不同的處理后裂解細(xì)胞，并加入底物熒光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin發(fā)出熒光(最強(qiáng)波長在560nm左右)。檢測(cè)得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對(duì)該轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件的影響。為避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)效率差異所造成的誤差，通常會(huì)轉(zhuǎn)入Renilla luciferase的報(bào)告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參(最強(qiáng)波長在465nm左右)，即雙熒光報(bào)告系統(tǒng)。

螢光素酶實(shí)驗(yàn)具體有哪些應(yīng)用？

1、驗(yàn)證microRNA同mRNA靶向互作。將待測(cè)基因的3’UTR序列插入報(bào)告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該microRNA，檢測(cè)熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。

2、驗(yàn)證microRNA同lncRNA靶向互作。將待測(cè)lncRNA序列插入報(bào)告基因載體的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)熒光素酶活性。

3、啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析。將啟動(dòng)子區(qū)域(約2k左右)進(jìn)行分段截短或突變，構(gòu)建入報(bào)告基因載體，檢測(cè)熒光素酶活性。

4、啟動(dòng)子SNP分析。一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性，可運(yùn)用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析其相對(duì)活性。

5、驗(yàn)證信號(hào)通路是否激活。將該信號(hào)通路的下游相應(yīng)原件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，檢測(cè)不同上游條件下，其熒光素酶活性，即下游信號(hào)通路的響應(yīng)情況。

雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)的具體步驟

1、報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建。將目的片段插入到熒光素酶表達(dá)的報(bào)告基因載體上，如pGL3-basic。

2、轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將報(bào)告基因質(zhì)粒和phRL-TK(內(nèi)參)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。共轉(zhuǎn)染時(shí)，由于內(nèi)參具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，因此報(bào)告基因質(zhì)粒：內(nèi)參轉(zhuǎn)染量一般為10:1~50:1。

Luciferase活性測(cè)定：

⑴ 初次使用時(shí)，配制LAR II，即Firefly luciferase的底物。將LAR II溶解在LAR II buffer中，并分裝-80℃避光保存。

⑵ 加入1X PLB，室溫裂解細(xì)胞15 min。

⑶配制Stop&Glo，即Renilla luciferase的底物，能夠終止LAR II的反應(yīng)。

⑷ 測(cè)定熒光值。向40 ul的LAR II中加入10 ul細(xì)胞裂解液，吹打混勻后，檢測(cè)讀數(shù)，即為Firefly luciferase的值。加入40 ul Stop&Glo，再次讀數(shù)，即為Renilla luciferase的值。

⑸ 數(shù)據(jù)處理。首先計(jì)算出每管的Firefly luciferase/Renillaluciferase的比值，再以control組的比值為單位1，即可得到不同處理組的相對(duì)luciferase活性，也就是該處理組基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控活性。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、為保證熒光素酶檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性可以采取適當(dāng)分裝后避光保存的方法，以免反復(fù)凍融和長時(shí)間暴露于室溫。

2、為取得最 佳檢測(cè)效果，同一批樣品最好保證相同的測(cè)定時(shí)間，通常為10s。