在我們日常的科研中，細胞實(shí)驗是每個(gè)課題必不可少的一部分。細胞實(shí)驗具有重要的意義，可以通過(guò)細胞實(shí)驗的數據評估藥物的有效性、毒性、耐藥性、藥物對細胞凋亡、增殖等作用的影響。下面我們來(lái)一起學(xué)習細胞實(shí)驗相關(guān)的知識把！

細胞的復蘇

細胞復蘇的概述

細胞復蘇的原則——快速融化：須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

實(shí)驗步驟

1、實(shí)驗前準備

（1）將水浴鍋預熱至37℃。

（2）用75％酒精擦拭紫外線(xiàn)照射30min的超凈工作臺臺面。

（3）在超凈工作臺中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養瓶等等。

2、取出凍存管

（1）根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

（2）從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時(shí)核對管外的編號。

3、迅速解凍

（1）迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的凍存細胞外的冰晶迅速融化。

（2）約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

4、平衡離心

   用架盤(pán)天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min。

5、制備細胞懸液

（1）吸棄上清液。

（2）向離心管內加入10ml培養液，吹打制成細胞懸液。

6、細胞計數

細胞濃度以5×105/ml為宜。

7、培養細胞

將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶?jì)?，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續培養培養，換液的時(shí)間由細胞情況而定。

注意事項

1、選擇合適的轉染試劑及復合物配比濃度；

2、純化 siRNA；

3、避免 RNA 酶污染；

4、健康的細胞培養物；

5、避免使用抗生素；

6、避免培養細胞用無(wú)血清的培養基。

細胞的傳代

實(shí)驗原理

細胞在培養瓶長(cháng)成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長(cháng)，同時(shí)也將細胞數量擴大，就須進(jìn)行傳代。

傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時(shí)也是利用培養細胞進(jìn)行各種實(shí)驗的必經(jīng)過(guò)程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。

實(shí)驗材料

1、細胞：貼壁細胞株；

2、試劑：0.25%胰酶、1640培養基（含10%小牛血清）；

3、儀器和器材：倒置顯微鏡，培養箱、培養瓶、吸管、廢液缸等。

實(shí)驗步驟

1、將長(cháng)滿(mǎn)細胞的培養瓶中原來(lái)的培養液棄去。

2、加入0.5—1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀(guān)察細胞。隨著(zhù)時(shí)間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時(shí)將胰酶棄去，加入10ml培養液終止消化。觀(guān)察消化也可以用肉眼，當見(jiàn)到瓶底發(fā)白并出現細針孔空隙時(shí)終止消化。一般室溫消化時(shí)間約為1—3分鐘。

4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實(shí)踐培養液塞好橡皮塞，置37℃下繼續培養。第二天觀(guān)察貼壁生長(cháng)情況。

注意事項

消化液配制方法：

稱(chēng)取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無(wú)Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，濾器過(guò)濾除菌，4℃保存，用前可在37℃下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使終濃度達0.02%。

細胞凍存

實(shí)驗原理

在－70℃以下時(shí)，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止狀態(tài)，故可以長(cháng)期保存。細胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過(guò)0~20℃階段的處理過(guò)程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。

實(shí)驗材料

生長(cháng)良好的培養細胞，新鮮培養基，DMSO，無(wú)菌塑料冷凍保存管，血球計數盤(pán)與蓋玻片。

實(shí)驗步驟

1、冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀(guān)察細胞生長(cháng)情形,細胞應該處于對數生長(cháng)期。

2、配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養基中，濃度為5-10％，混合均勻，置于室溫下待用。

3、依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞與凍存管內，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數細胞濃度。

4、先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。

5、接著(zhù)置于-20℃冰箱，約30-60min。

6、置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。

7、置于液氮罐中長(cháng)期保存。

8、同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。

細胞培養中的無(wú)菌操作技術(shù)

注意事項

1、實(shí)驗進(jìn)行前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作臺面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺風(fēng)扇運轉10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實(shí)驗完畢后，將實(shí)驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作臺面。操作間隔應讓無(wú)菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細胞株的操作。

2、無(wú)菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，實(shí)驗操作應在臺面的中央無(wú)菌區域，勿在邊緣的非無(wú)菌區域操作。

3、小心取用無(wú)菌的實(shí)驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或容器瓶口，亦不要在打開(kāi)的容器正上方操作實(shí)驗。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4、工作人員應注意自身的安全，須穿戴實(shí)驗衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗。操作過(guò)程中，應避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心毒性藥品，并避免尖銳針頭的傷害等。

5、定期檢測下列項目：

（1）CO2 鋼瓶的CO2壓力。

（2）CO2 培養箱的CO2濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染(水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換)。

（3）無(wú)菌操作臺內的airflow 壓力，定期更換紫外線(xiàn)燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預濾網(wǎng)(300小時(shí)/預濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。

6、水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。

TUNEL染色檢測細胞凋亡

實(shí)驗概述

細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過(guò)程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在鈣離子和鎂離子依賴(lài)的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細胞的檢測，這類(lèi)方法一般稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。

實(shí)驗原理

過(guò)氧化物酶標記測定法。

原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過(guò)氧化物酶可產(chǎn)生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞。

實(shí)驗材料

試劑配制：

1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。

4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調節pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。

5、TdT酶反應液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。

6、洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml。

7、0.05％二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過(guò)濾后，加過(guò)氧化氫至0.02%。

8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。

9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、過(guò)氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ONCOR）。

實(shí)驗步驟

1、標本預處理：

（1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無(wú)水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

（2）冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

（3）培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個(gè)/ml細胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進(jìn)行操作。

2、色缸中加入含2％過(guò)氧化氫的PBS，于室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。

4、用濾紙小心吸去切片周?chē)亩嘤嘁后w，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中于37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。

5、將切片置于染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動(dòng)。

6、組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過(guò)氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，后1次5min。

10、于室溫用甲基綠進(jìn)行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并記錄實(shí)驗結果。

注意事項

要設立陽(yáng)性和陰性細胞對照。陽(yáng)性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽(yáng)性細胞對照可使用地塞米松處理的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶。

MTT實(shí)驗

實(shí)驗原理

MTT分析法以活細胞代謝物還原劑MTT噻唑藍為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細胞線(xiàn)粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開(kāi)裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量?jì)H與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數目。

實(shí)驗步驟

1、接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個(gè)細胞懸液，以每孔1000－10000個(gè)細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。

2、培養細胞：同一般培養條件，培養3－5天（可根據試驗目的和要求決定培養時(shí)間）。

3、呈色：培養3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml） 20ul。繼續孵育4小時(shí)，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結晶物充分融解。

4、比色：選擇490nm波長(cháng)，在酶聯(lián)免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時(shí)間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長(cháng)曲線(xiàn)。

注意事項

1、選擇適當得細胞接種濃度。

2、避免血清干擾。

3、設空白對照。

4、MTT實(shí)驗吸光度要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線(xiàn)關(guān)系。

實(shí)驗應用

1、檢測細胞表面以及胞內的各種標志，對細胞進(jìn)行分群鑒定以及比較各種蛋白表達量高低。

2、檢測細胞的增殖以及凋亡。

3、流式細胞術(shù)可用來(lái)分析細胞周期。