劃痕實(shí)驗(yàn)和 Transwell 實(shí)驗(yàn)方法比較

原理

在體外培養(yǎng)血或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細(xì)胞的生長遷移能力。

通過不同分組之間的細(xì)胞對(duì)于劃痕區(qū)修復(fù)能力的不同，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力的差別。

用途

探討某個(gè)基因或某種藥物對(duì)細(xì)胞遷移能力的影影響。

材料與儀器

[材料]細(xì)胞樣品

[試劑]無血清培養(yǎng)基、PBS

[儀器，耗材]6 孔板、marker 筆、直尺、槍頭、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡。

步驟

一.準(zhǔn)備:

所有能火菌的器械都要滅菌，直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30 min (超凈臺(tái)內(nèi))。

二.流程:

1.培養(yǎng)板劃線: 先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺比著，均勻得劃橫線，大約每隔 0.5~1 cm 一道，橫穿過孔，每孔至少穿過 5 條線；

2.鋪細(xì)胞: 在孔中加入約 5x105 個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過夜能鋪滿；

3.細(xì)胞劃線:第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜;

4.洗細(xì)胞: 用 PBS 洗細(xì)胞 3 次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基；

5.細(xì)胞培養(yǎng)及觀察: 放入 37C、5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng);按 0，6，12，24 小時(shí)取樣，倒置顯微鏡觀察特定位置細(xì)胞遷移情況并拍照；

6.結(jié)果分析: 使用 ImageJ 軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取 6-8 條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。

                           下面是照片，細(xì)胞 NIH3T3:

                                                0 h

                                                     6h

                                                     12h

                                                    24h

注意事項(xiàng)

1、鋪細(xì)胞最好使用 6 孔板，因?yàn)?6 孔板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，而且因?yàn)橛?5 條定位線與劃痕相交，這樣就有10 個(gè)可固定監(jiān)測點(diǎn)，不作重復(fù)，誤差也很小。

2、如果你連續(xù)監(jiān)測 24 小時(shí)，你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果，而不是單純的細(xì)胞遷移。

如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移，你可以先用絲裂霉素 (1 ug/ml) 處理一小時(shí)，抑制細(xì)胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。另外，使用無血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影影響。

3、照片拍完之后，可以用 ImageJ 來測量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。

4、雖然無血清培養(yǎng)可以略細(xì)胞增殖的影響，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會(huì)慢很多

5、應(yīng)盡量清洗掉散落的細(xì)胞，對(duì)于一些細(xì)胞，低血清濃度下也能重新貼壁并增殖，此外也影響數(shù)據(jù)美觀。

常見問題

1.劃痕法測量適用的細(xì)胞范圍較小，一般只適用于上皮細(xì)胞，纖維樣細(xì)胞。

2.雖然無血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會(huì)慢很多。

3、在用 PBS 緩沖液沖洗時(shí)，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)拍照結(jié)果。

4、一般做劃痕實(shí)驗(yàn)，需要排除細(xì)胞增殖的影響一般在不影響細(xì)胞增殖的情況下采用低血清(<2%)或者無血清，否則細(xì)胞增殖就不能忽略這樣對(duì)于遷移較慢的細(xì)胞就需要延長拍攝時(shí)間 (也可用絲裂酶處理一小時(shí))。

5、按照 6 孔板背后畫線的垂直方向劃痕，可以形成若千交叉點(diǎn)，作為固定的檢測點(diǎn)，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問題。

6、每次拍照前、后，盡量換掉培養(yǎng)基，去除飄落的細(xì)胞，能得到較為干凈的劃痕區(qū)域。