原理

細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識(shí)別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酷絲氨酸 (PS) 從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使 PS暴露在細(xì)胞膜外表面。

PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使 PS 暴露在細(xì)胞膜外。

Annexin V 是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白Annexin V 具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性對(duì)PS有高度的親和性。

因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。

因此，可以建立一種用 Annexin V 結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。

材料與儀器

器材:

離心機(jī)、 冰箱、 離心管、 流式細(xì)胞儀

試劑:

細(xì)胞孵育緩沖液、 HEPES、NaOH  NaC、CaCl2、標(biāo)記液、PI

步驟

一、細(xì)胞收集:

(1)懸浮細(xì)胞直接收集到 10 mL 的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為 (1~5) x 10/ml。

(2) 500~1000 r/min 離心 5 min ，棄去培養(yǎng)液。

二、細(xì)胞洗滌:

(1) 用育緩沖液洗滌 1 次。

(2) 500~1000 r/min 離心 5min 。

三、細(xì)胞標(biāo)記:

(1) 用 100 uL 的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞。

(2)室溫下避光孵育 10~15min。

(3)500~1000 r/min 離心 5 min 沉淀細(xì)胞育緩沖液洗 1次。

(4)加入熒光(SA-FLOUS) 溶液4C下育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)。

四、流式細(xì)胞儀分析:

流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用 488 nm，用一波長為515 nm 的通帶濾器檢測 FITC 熒光，另一波長大于 560 nm 的濾器檢測 PI。

五、結(jié)果判斷:

凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如 PI有抗染性，壞死細(xì)胞則不能。細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA 可被 PI 著染產(chǎn)生紅色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì)胞凋亡的早期 PI 不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。正?；罴?xì)胞與此相似。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為 (FITC-/PI-) ; 右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)(FITC+/PI-)。