原理

主要根據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)在細(xì)胞、亞細(xì)胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變，包括細(xì)胞核的改變、細(xì)胞器的改變、細(xì)胞膜成分的改變和細(xì)胞形態(tài)的改變等進(jìn)行檢測。

材料與儀器

細(xì)胞  PBS   PI  蒸餾水  乙醇  棕色瓶  400目篩網(wǎng)   流式細(xì)胞儀

步驟

一、收集細(xì)胞

收集細(xì)胞{數(shù)目約 (1~ 5) x106個(gè)/mL] ，500~1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。

二、細(xì)胞洗滌

3 ml PBS洗滌1次。

三、乙醇固定

離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定4°C，1-2小時(shí)。

四、細(xì)胞重懸

離心棄去固定液，3 mIPBS重懸5 min。

五、細(xì)胞過濾

400目的篩網(wǎng)過濾1次，500-1000 r/min離心5min，棄去PBS。

六、染色

用1 ml PI染液染色，4C避光30 min。

七、流式細(xì)胞儀檢測

PI用氟離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488 nm,發(fā)射光波波長大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光分析P熒光強(qiáng)度的直方圖也可分析前散射光對側(cè)散射光的散點(diǎn)圖。

八、結(jié)果判斷

在前散射光對側(cè)散射光的散點(diǎn)圖或地形圖上，凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞相比，前散射光降低，而側(cè)散射光可高可低，與細(xì)胞的類型有關(guān);在分析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在Pl熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞在G1/GO期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G1/GO期所在位置的熒光強(qiáng)度為1.0，則一個(gè)典型的凋亡細(xì)胞樣本其亞二倍體峰的熒光強(qiáng)度為0.45，可用雞和鮮魚的紅細(xì)胞的PI熒光強(qiáng)度做參照標(biāo)準(zhǔn)，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細(xì)胞碎片而是完整的細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

細(xì)胞凋亡時(shí)，其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因?yàn)镈NA含量的降低，或者是因?yàn)镈NA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)里時(shí)應(yīng)該注意。

常見問題

1.由于凋亡細(xì)胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對凋亡細(xì)胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，其DNA可染性降低。許多學(xué)者把這種DNA可染性的降低認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的標(biāo)志之一。

2.凋亡細(xì)胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細(xì)胞儀上，前散射光與細(xì)胞的大小有關(guān)，而側(cè)散射光反映的是光在細(xì)胞內(nèi)的折射作用，與細(xì)胞內(nèi)的顆粒多少有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞固縮，體積變小，故前散射光降低，這一特性往往被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)之一。此外細(xì)胞凋亡時(shí)由于染色體降解，核破裂形成，細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細(xì)胞側(cè)散射光常增加。細(xì)胞壞死時(shí)，由于細(xì)胞腫脹，其前散射光增大;側(cè)散射光在細(xì)胞壞死時(shí)也增大，因此可根據(jù)前散射光和側(cè)散射光區(qū)別凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。但需要注意的是，根據(jù)前散射光和側(cè)散射光判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被檢測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比率影響很大。因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好，而在腫瘤細(xì)胞凋亡中，其可靠性就較差。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細(xì)胞最主要的優(yōu)點(diǎn)是可以將光散射特性與細(xì)胞的表面免疫熒光分析結(jié)合起來，用以區(qū)別經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋E亞型。也可用于活細(xì)胞的分類。