原理

目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞碼作保護(hù)劑這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶;相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。

復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷，同時(shí)防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶，并防止DMSO在液體狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞的毒害作用，快速使細(xì)胞進(jìn)入復(fù)蘇和生長(zhǎng)狀態(tài)。

用途

更新種子庫(kù)中的細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)需要

材料與儀器

[材料與試劑]待復(fù)蘇的細(xì)胞、100 X 雙抗、胎牛血清、相應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基、75% 乙醇

[實(shí)驗(yàn)儀器]37度恒溫水浴鍋、細(xì)胞培養(yǎng)血 (6cm)倒置相差顯微鏡、離心機(jī)、細(xì)胞房專用超凈臺(tái)、移液槍及移液槍頭 (無(wú)菌或滅菌后烘干)培養(yǎng)箱、移液管。

步驟

一、試劑準(zhǔn)備 (以 293T 細(xì)胞為例)

1、DMEM 完全培養(yǎng)基 (10% 胎牛血清)44.5mL DMEM+5 mL胎牛血清+500 uL 100 X雙抗，搖勻，4°C 冷藏保存，使用前30 min放于細(xì)胞房中室溫預(yù)熱。

2、提前將水浴鍋打開(kāi)，設(shè)置 37°C。

二、細(xì)胞復(fù)蘇

1、超凈工作臺(tái)使用前紫外線照射30 min，打開(kāi)通風(fēng)，用75% 酒精擦拭臺(tái)面，保持臺(tái)面干凈整潔。

2、將凍存細(xì)胞從-80°C 冰箱或液氮罐中取出，立即放入 (2 min 內(nèi)，如從液氮中取出，粗需要待凍存管中漏進(jìn)去的液氮揮發(fā))37C 恒溫水浴中預(yù)熱水浴鍋中 (或在手心中反復(fù)摩擦) ，不?；蝿?dòng)以化凍，并盡量保持凍存管的管口不浸入水中。

3、在室溫下以1000 rpm的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞懸液離心5 min并棄上清(離心的速度和時(shí)間根據(jù)細(xì)胞系的不同有所差異)。

4、用1 mL DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移進(jìn)6 cmm (每血中加入3-4 mL細(xì)胞懸液)中，搖晃均勻，放入37°C 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中 (5%CO2)。

5、過(guò)夜后 (~12h) ，觀察復(fù)蘇細(xì)胞的狀態(tài)，并及時(shí) (每48 h) 更換DMEM完全培養(yǎng)基一次，并依據(jù)情況，決定是否需要重新凍存細(xì)胞保種。

6、懸浮細(xì)胞操作同上，培養(yǎng)基使用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿為細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37°C 細(xì)胞搖床 (5%CO2) 、110 rpm 。

注意事項(xiàng)

1、凍存記錄:保存凍存細(xì)胞的精確記錄是很重要的。需建立細(xì)胞生長(zhǎng)史、名稱、傳代次數(shù)、凍存日期、復(fù)蘇次數(shù)、生長(zhǎng)培養(yǎng)液和在凍存器中的位置都是應(yīng)記錄的項(xiàng)目。

2、凍存液: 應(yīng)用補(bǔ)充 10%~20% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基和 10% 甘油或 DMSO。最佳凍存液配方在比較FBS 濃度 (10%~20%)，DMSO(5%~20%) 或甘油 (10%~15%) 濃度后決定

在低溫狀態(tài)保存數(shù)天后進(jìn)行復(fù)蘇效率的比較。

3、DMSO具有細(xì)胞毒性，復(fù)蘇細(xì)胞的過(guò)程操作要迅速，并用 3 倍體積以上的完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。

4、凍存細(xì)胞應(yīng)選擇傳代次數(shù)較少的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞傳代高于15-20 代后，細(xì)胞應(yīng)丟棄，復(fù)蘇新的細(xì)胞再進(jìn)行試驗(yàn)。

5、復(fù)蘇后的細(xì)胞不能立即進(jìn)行試驗(yàn)，等待細(xì)胞穩(wěn)定后，傳代 2-3 代后，方可進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

6.復(fù)蘇過(guò)程中需要特別注意凍存管中是否漏入液氮，如漏有液氮需等液氮揮發(fā)后再放入水浴鍋中在水浴鍋中化凍時(shí)，盡量避免管口沾水，導(dǎo)致復(fù)蘇的細(xì)胞有發(fā)生污染的可能。

常見(jiàn)問(wèn)題

1、復(fù)蘇細(xì)胞的狀態(tài)與凍存前以及復(fù)蘇過(guò)程都有關(guān)系，應(yīng)選擇狀態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。

2、-80°C 凍存的細(xì)胞一般應(yīng)在 3-6 個(gè)月內(nèi)進(jìn)行復(fù)蘇或處理。若想長(zhǎng)久保存，應(yīng)轉(zhuǎn)移進(jìn)液氮中，可以保存1年以上。

3、.復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳，可考慮重新復(fù)蘇，若重新復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)仍舊不佳，可考慮適當(dāng)提高胎牛血清的用量 (從10%提升至15%，最大提升至20%)，待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后再使用平時(shí)使用的培養(yǎng)基。