一、細(xì)胞凋亡的機(jī)理

1. 線粒體途徑:

線粒體是細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要調(diào)控場所并參與了大多數(shù)細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。此通路由含 BH3結(jié)構(gòu)域的 Bc-l2家族成員 Bid、Bad、Bim、Harikari、Noxa 等在接受到胞內(nèi)的死亡信號后激活。這些含 BH3結(jié)構(gòu)域的 Bc-l2家族成員與Bax 亞家族成員Bax、Bak 等作用，導(dǎo)致后者的寡聚并插入線粒體膜引起線粒體膜通透性改變，跨膜電位丟失?釋放細(xì)胞色素 C和其他蛋白。細(xì)胞色素 C的釋放是線粒體凋亡路徑的主要步驟，在 ATP/dATP 存在的情況下細(xì)胞色素 C與凋亡蛋白酶活化因子Apaf1形成多聚復(fù)合體，通過Apaf-1氨基端的 Caspase 募集結(jié)構(gòu)域（CARD）募集胞質(zhì)中的 Caspase-9前體，并使其自我剪切活化并啟動Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的 Caspase-3和 Caspase7，完成其相應(yīng)底物的剪切，引起細(xì)胞凋亡。

2. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑：

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路不同于線粒體或死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路。Caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子平衡的破壞或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的過量積累都會誘導(dǎo)Caspase-12表達(dá)，同時也導(dǎo)致胞質(zhì)的Caspase-7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面。Caspase-7激活Caspase-12，激活的Caspase-12可進(jìn)一步剪切Caspase3而引發(fā)細(xì)胞凋亡。

3. 死亡受體途徑：

胞外的死亡信號可通過死亡受體轉(zhuǎn)入胞內(nèi)。死亡受體為一類跨膜蛋白?屬腫瘤壞死因子受體（TNFR）基因超家族。其胞外部分都含有一富含半胱氨酸的區(qū)域，胞質(zhì)區(qū)有一由同源氨基酸殘基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，有蛋白水解功能，使死亡信號得以進(jìn)一步傳遞而啟動凋亡。

二、細(xì)胞凋亡檢測的方法

1. 形態(tài)學(xué)觀察

形態(tài)學(xué)觀察就是應(yīng)用各種染色法可觀察到凋亡細(xì)胞的各種形態(tài)學(xué)特征，如組織切片或細(xì)胞涂片，經(jīng)固定, 用 Giemsa染 色 、孚 爾 根 染 色 或 Hoechest33342等熒光染色, 在光學(xué)顯微鏡下鏡檢, 可觀 察到染色質(zhì)凝集、邊緣化、凋亡小體出現(xiàn)、巨噬細(xì)胞的吞噬等現(xiàn)象。

2. DNA電泳 

提取細(xì)胞基因組DNA, 進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳, 并用溴化乙錠進(jìn)行染色時, 凋亡細(xì)胞的DNA顯示出 180～ 200 bp及其不同倍數(shù)的梯帶。而壞死細(xì)胞的DNA電泳時呈彌散的涂抹狀。

3. TUNEL測定法 

TUNEL測定法又稱 DNA 斷裂原位末端標(biāo)記法 。由于凋亡細(xì)胞DNA為核酸酶所降解產(chǎn)生 3’-OH的缺口和末端，故可用原位缺口平移法或原位末端標(biāo)記法顯示凋亡細(xì)胞。而正常細(xì)胞沒有DNA斷裂或者只有少量的DNA發(fā)生斷裂不被顯色。但由于在壞死細(xì)胞內(nèi)也可能存在DNA片段化，所以只有DNA鏈普遍斷裂才能證明細(xì)胞發(fā)生凋亡。

4.Annexin V／PI 雙染法測定

Annexin V／PI 法是根據(jù)細(xì)胞凋亡早期細(xì)胞膜的磷脂對稱性發(fā)生改變磷脂酰絲氨酸（PS）由細(xì)胞膜內(nèi)移位到細(xì)胞膜外，采用 Annexin V／PI 雙染，并通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡的方法。Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸（PS）有高度親和力，在正常生理條件下，PS主要位于質(zhì)膜的內(nèi)葉。在啟動細(xì)胞凋亡時，PS被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外膜上。PS一旦到達(dá)膜外，即可被Annexin V-FITC結(jié)合，從而檢測出細(xì)胞的凋亡。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)可與雙鏈DNA特異性結(jié)合，并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，正常情況下無法透過細(xì)胞膜。由于凋亡晚期或壞死細(xì)胞膜喪失完整性，PI可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)對DNA進(jìn)行染色，與Annexin V搭配使用，可區(qū)分處于不同凋亡時期的細(xì)胞。