實(shí)驗(yàn)技巧
定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法學(xué)介紹
目前較主流的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法有5種，分別是Label-free、iTRAQ、SILAC、MRM(MRMHR)、和SWATH。簡(jiǎn)述如下：
2.1 Label-free
Label-free定量，即非標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)，不需要對(duì)比較樣本做特定標(biāo)記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)便可得到樣品間蛋白表達(dá)量的變化，通常用于分析大規(guī)模蛋白鑒定和定量時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
Label-free定量不需要標(biāo)記處理，操作簡(jiǎn)單，可以做任意樣本的總蛋白質(zhì)差異定量，但對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的穩(wěn)定性、重復(fù)性要求較高，準(zhǔn)確性也較標(biāo)記定量差。因此，Label-free技術(shù)適合于大樣本量的定量比較，以及對(duì)無(wú)法用標(biāo)記定量實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
iTRAQ定量是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用最廣泛的技術(shù)， 該技術(shù)的核心原理是標(biāo)記和定量，將多肽的含量轉(zhuǎn)化為114、115、116和117同位素的含量(或113、114、115、116、117、118、119和121的8標(biāo)記)，從而簡(jiǎn)化了定量的復(fù)雜性，最終通過(guò)多肽定量值回歸到蛋白的定量值，從而最終測(cè)定出不同樣本之間蛋白質(zhì)的差異。
iTRAQ定量不依賴樣本，可檢測(cè)出較低豐度蛋白，胞漿蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等，且定量準(zhǔn)確，可同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，并可同時(shí)得出鑒定和定量的結(jié)果，特別適用于采用多種處理方式或來(lái)自多個(gè)處理時(shí)間的樣本的差異蛋白分析。金開(kāi)瑞質(zhì)譜平臺(tái)應(yīng)用iTRAQ定量技術(shù)，可鑒定多達(dá)6000種蛋白（以人HepG2為例），重復(fù)樣品間的蛋白表達(dá)量相關(guān)性可達(dá)到0.95以上。
2.3 SILAC
SILAC定量的基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩(wěn)定同位素(中性或重型)標(biāo)記的必需取代細(xì)胞基中相應(yīng)氨基酸，細(xì)胞經(jīng)5-6個(gè)倍增周期后，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸完全摻入到細(xì)胞新合成的蛋白質(zhì)中替代了原有氨基酸。不同標(biāo)記細(xì)胞的裂解蛋白按細(xì)胞數(shù)或蛋白量等比例混合，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜圖中兩個(gè)同位素型肽段的面積比較進(jìn)行相對(duì)定量，屬于體內(nèi)代謝標(biāo)記法。
SILAC屬于體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，更接近樣品真實(shí)狀態(tài)，標(biāo)記效率高達(dá)100%，且標(biāo)記效果穩(wěn)定，不僅適合于進(jìn)行全細(xì)胞蛋白分析，還適合于膜蛋白的鑒定和定量，每個(gè)樣本只需要幾十微克的蛋白量。SILAC定量適用于活體培養(yǎng)細(xì)胞的分析，對(duì)多個(gè)樣品或同一樣品不同條件下全細(xì)胞蛋白或亞細(xì)胞蛋白進(jìn)行差異比較。
2.4 MRM和MRMHR
MRM是一種基于已知信息或假定信息設(shè)定質(zhì)譜檢測(cè)規(guī)則，對(duì)符合規(guī)則的離子進(jìn)行信號(hào)記錄，去除大量不符合規(guī)則離子信號(hào)的干擾，從而得到質(zhì)譜信息的一種數(shù)據(jù)獲取方式，屬于目標(biāo)蛋白質(zhì)組。其關(guān)鍵在于首先要能夠檢測(cè)到具有特異性的母離子，然后只將選定的特異性母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)，最后去除其他子離子的干擾，只對(duì)選定的特異子離子進(jìn)行質(zhì)譜信號(hào)的采集。金開(kāi)瑞依據(jù)前人的工作在AB SCIEX的5600-plus 儀器上開(kāi)發(fā)出了MRMHR技術(shù)，因?yàn)镸RMHR采納了高精度的數(shù)據(jù)，因此選擇Transition更加可信，定量更加準(zhǔn)確。
MRMHR技術(shù)通過(guò)兩級(jí)離子選擇，排除大量干擾離子，使質(zhì)譜的化學(xué)背景降低，目標(biāo)檢測(cè)物的信噪比顯著提高，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高靈敏度，并具有重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，特別適合于已知蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)表達(dá)量差異驗(yàn)證，可以檢測(cè)較低豐度的蛋白，但一次MRM實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)到20個(gè)左右的目標(biāo)蛋白。
2.5 SWATH
SWATH是瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院的Ruedi Aebersold 博士及其團(tuán)隊(duì)與AB-SCIEX于2012年聯(lián)合推出的一項(xiàng)全新的質(zhì)譜采集模式技術(shù)，是MS/MSALL技術(shù)的一種擴(kuò)展。與傳統(tǒng)的shot-gun技術(shù)相比，SWATH采集模式能夠?qū)呙鑵^(qū)間內(nèi)所有的肽段母離子經(jīng)過(guò)超高速掃描并進(jìn)行二級(jí)碎裂，從而獲得完整的肽段信息，是一種真正全景式的、高通量的質(zhì)譜技術(shù)。金開(kāi)瑞現(xiàn)有的Triple-TOF 5600-plus質(zhì)譜系統(tǒng)，使SWATH定量具有較高的準(zhǔn)確度和動(dòng)態(tài)范圍，可檢測(cè)到蛋白質(zhì)的豐度差異極大，跨越4個(gè)數(shù)量級(jí)。