實(shí)驗(yàn)技巧
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組正確做法是這樣？原來(lái)我一直是錯(cuò)的
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組時(shí)，我們常常碰到以下情況：如有40只皮下荷瘤小鼠需隨機(jī)分為4組，但每只腫瘤體積大小各異；又如有50只SD大鼠，需要分5組，但性別和體重均不一，該如何將其隨機(jī)分配呢？對(duì)于大多數(shù)的我們，很可能會(huì)參雜人為因素對(duì)動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)，殊不知這并不是一種科學(xué)的做法。原來(lái)實(shí)驗(yàn)分組不像抓鬮擲硬幣，它需應(yīng)用專門的隨機(jī)數(shù)字表，還包括完全隨機(jī)設(shè)計(jì)、隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)等隨機(jī)方法。本期就一起看看如何科學(xué)分組！
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)，美國(guó)動(dòng)物委員會(huì)要求投稿時(shí)，需要對(duì)動(dòng)物基本信息包括動(dòng)物來(lái)源、品系、生活環(huán)境、分組方法等作出說(shuō)明[1]。然而大多數(shù)發(fā)表的文章，都未描述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組方法，而被編輯索要原始數(shù)據(jù)來(lái)證明數(shù)據(jù)的可靠性[2]?？梢?jiàn)，分組十分重要。那么實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組講究哪些原則，又該如何實(shí)施呢？
動(dòng)物分組一般需要遵循對(duì)照和隨機(jī)的原則，這里主要關(guān)乎2個(gè)問(wèn)題，一是如何設(shè)計(jì)對(duì)照組？二是如何保證動(dòng)物隨機(jī)地分配到這些組中？
問(wèn)題一： 如何設(shè)置對(duì)照組？
為了保證能得到科學(xué)有效的數(shù)據(jù)，分組的第一個(gè)設(shè)計(jì)原則便是要設(shè)立對(duì)照組。一般觀察一個(gè)藥物或者某種外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響需要設(shè)置3組對(duì)照，空白對(duì)照組（負(fù)對(duì)照組、 ）、模型對(duì)照組（正對(duì)照組）和陽(yáng)性對(duì)照組[2]。
空白對(duì)照組：指不經(jīng)任何處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，目的是為了突出正常動(dòng)物與疾病動(dòng)物之間有何差別；如研究某種藥物對(duì)糖尿病小鼠的治療效果，該組即為未患有糖尿病的野生型小鼠，必要時(shí)可以給予生理鹽水或其它藥物的溶劑等。
模型對(duì)照組：即疾病動(dòng)物模型，給予陰性處理；目的是觀察與治療組相比，藥效如何及在疾病狀態(tài)下的動(dòng)物表現(xiàn)；如要觀察某種藥物是否對(duì)乳腺癌有治療效果，治療組動(dòng)物需要腹腔給藥，模型組則是注射同等劑量的不包括藥物的溶劑，如生理鹽水；
陽(yáng)性對(duì)照組：通常是給予疾病模型動(dòng)物已知應(yīng)該有效的藥物或者其他有效因素的處理；目的是對(duì)比某受試藥物與陽(yáng)性藥物對(duì)比，是否有效；舉例：已知阿霉素對(duì)乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用，因此我們可以選用阿霉素作為陽(yáng)性對(duì)照，來(lái)判斷此受試藥物的治療效果。
那么加上對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一般共需要幾組？
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，除了設(shè)置上述對(duì)照組外，還需加上處理因素那一組，一般會(huì)設(shè)置劑量梯度，最好是設(shè)計(jì)3個(gè)以上，以形成劑量效應(yīng)。綜上，建議分組是：①空白組，②模型組，③模型＋陽(yáng)性藥物模型，④模型＋＋低劑量藥物，⑤模型＋中劑量藥物，⑥模型＋高劑量藥物。
注：如果實(shí)驗(yàn)對(duì)象是不需要疾病狀態(tài)，則可不設(shè)立模型組；
注：并非每一個(gè)實(shí)驗(yàn)都能找到陽(yáng)性對(duì)照藥，因此，也不是每一個(gè)實(shí)驗(yàn)都需要設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組；
注：具體劑量設(shè)計(jì)，可以參考文末鏈接（藥物濃度的設(shè)計(jì)）
問(wèn)題二： 每組幾只合適？
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)遵循實(shí)行“3R原則”，包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的替代、減少和優(yōu)化原則，其中減少即指盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量。查閱文獻(xiàn)，并未發(fā)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)目有絕對(duì)要求，但在減少的同時(shí)，一定要滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。統(tǒng)計(jì)學(xué)上要求一般至少每組有6個(gè)可用數(shù)據(jù)，才有意義。
一般小鼠的每組一般不少于10只；
一般大鼠每組不少于6只；
大動(dòng)物等級(jí)越高，價(jià)格越貴，根據(jù)情況可適當(dāng)減少，但一般不能少于4-5只。
問(wèn)題三： 如何進(jìn)行隨機(jī)分配？
隨機(jī)分配可以保證數(shù)據(jù)的科學(xué)性，可以保證數(shù)據(jù)更有說(shuō)服力，因此實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組應(yīng)嚴(yán)格按照隨機(jī)原則進(jìn)行，使每只動(dòng)物都有同等機(jī)會(huì)被分配到各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中去。
根本不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢?shí)驗(yàn)對(duì)象，分組時(shí)常用的方法有：完全隨機(jī)設(shè)計(jì)、隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)等[3-4]。實(shí)現(xiàn)隨機(jī)分組時(shí)需要利用隨機(jī)數(shù)字表以及隨機(jī)數(shù)余數(shù)分組法。
什么是隨機(jī)數(shù)表？也稱亂數(shù)表，由計(jì)算機(jī)隨機(jī)生成的從0到9十個(gè)數(shù)字所組成的數(shù)表，每個(gè)數(shù)字在表中出現(xiàn)的次數(shù)概率基本相同。分組時(shí)，需要借用這個(gè)工具，實(shí)現(xiàn)隨機(jī)分配。
方法一：完全隨機(jī)設(shè)計(jì)
通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表或用計(jì)算機(jī)產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)將動(dòng)物不加區(qū)分地隨機(jī)分組[5]；
適用范圍：所有動(dòng)物必須是“同質(zhì)”或者近似“同質(zhì)”。也就是說(shuō)所有的動(dòng)物性別、體重及其他相關(guān)因素（如荷瘤體積）是一樣的，或是近似的。
操作步驟：
編號(hào): 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從1 到N 編號(hào)，一般可以可按體重大小編號(hào)；
獲取隨機(jī)數(shù)字: 從隨機(jī)數(shù)字表中任意一個(gè)數(shù)開始，沿同一方向順序獲取N個(gè)隨機(jī)數(shù)字；
求余數(shù): 隨機(jī)數(shù)除以組數(shù)求余數(shù)，若整除則余數(shù)取組數(shù)；
分組: 按余數(shù)分組；
調(diào)整: 如不均分，繼續(xù)按順序抄下一個(gè)隨機(jī)數(shù)，除數(shù)變?yōu)閿?shù)目最多的那組的數(shù)字a，得到的余數(shù)作為被抽的序號(hào)(若整除則余數(shù)為a)，直到調(diào)到相等為止。
舉例將15只小鼠分為3組：先按體重大小給動(dòng)物編號(hào)，然后利用隨機(jī)表連續(xù)抄取15個(gè)數(shù)字，然后以組數(shù)3求余數(shù)，即除以3，余數(shù)1、2、3分別代表進(jìn)入甲、乙及丙組。然而得甲組多一只（6只），查隨機(jī)數(shù)字表，下一個(gè)隨機(jī)數(shù)字為55。55/6余1，因此，將第1 例從甲組調(diào)整到丙組中去。
表：完全隨機(jī)法分組舉例
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，且能實(shí)現(xiàn)隨機(jī)分配的原則；
缺點(diǎn)：一是過(guò)程比較繁瑣，通常一次操作不能使各組的數(shù)目相等，需要調(diào)整；數(shù)目太多不易快速實(shí)現(xiàn)分組；且若動(dòng)物間有較大差異，如體重區(qū)間較大，則不適用這種方法。
方法二：隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)
然而如果一批小鼠中，小的有18g的，大的有30g的，體重相差比較大，若按上述完全隨機(jī)方法分配到各組，很可能有的組分到體重特別大的，有的組分到特別小的。這樣難以保證平均分配，因此隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)應(yīng)運(yùn)而生。
隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)：叫均衡隨機(jī)化或限制性隨機(jī)化，即先將一定數(shù)目和比例的動(dòng)物分為幾個(gè)區(qū)組（block）（一般＞3），如體重相近的動(dòng)物、性別一致的動(dòng)物等。區(qū)組的長(zhǎng)度最好為組數(shù)的2倍以上，太小易造成不隨機(jī)，如有4個(gè)組，則區(qū)組長(zhǎng)度最好選擇8以上。
舉例：有40只SD大鼠，重量在180-220克之間，需要分為4組，即每組10只（甲乙丙丁），應(yīng)先將動(dòng)物按體重配成若干個(gè)區(qū)組，再把每區(qū)組動(dòng)物隨機(jī)分配各組。
首先，進(jìn)行大鼠稱重，按順序排序；
分區(qū)組：嘗試可將這些大鼠按體重分為4個(gè)區(qū)組（假設(shè)180~190g/8只，190-200g/12只，200-210g/16只，210-220g/4只），即4窩，分區(qū)時(shí)每窩的數(shù)量至少大于4；
編號(hào)：依次對(duì)這4窩大鼠編號(hào)，第一窩1、2、3、4…8，以此類推，編號(hào)到40；
隨機(jī)分配區(qū)組1：將這8只隨機(jī)分配給4組，每組各2只，分組方法即采用上述隨機(jī)數(shù)字表，按隨機(jī)數(shù)余數(shù)分配到每個(gè)組；
隨機(jī)分配剩余3個(gè)區(qū)組，方法同上。
優(yōu)勢(shì)：區(qū)間分組將保證了實(shí)驗(yàn)組間的生物差異減到了最小，遵循了一致性原則與隨機(jī)性原則，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
注：有時(shí)候我們會(huì)碰到多個(gè)因素，則需要依次分區(qū)，如：40只體重差異較大的小鼠，雌雄不一，此時(shí)我們不能只按照體重區(qū)組分配，需要先把雌雄分開，然后各自按體重分層。即它要求隨機(jī)先按某一因素分成相等的幾組，再在組內(nèi)按另一因素分成幾個(gè)區(qū)。
注：當(dāng)數(shù)目較少時(shí)，我們可以手動(dòng)計(jì)算分組；但是當(dāng)數(shù)目太多時(shí)，我們需要借助軟件如excel或SPSS，省去了去查閱隨機(jī)數(shù)字表的麻煩，幾分鐘就可完成一個(gè)隨機(jī)分配過(guò)程。
綜上我們可以看到，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組我們需要遵循對(duì)照和隨機(jī)的原則，這樣才可以保證數(shù)據(jù)更加具有科學(xué)性和統(tǒng)計(jì)意義，最好不要加入主觀因素進(jìn)行分組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要環(huán)節(jié)，我們必須在實(shí)驗(yàn)開始前就必須認(rèn)真考慮清楚。希望大家通過(guò)我們的文章認(rèn)識(shí)到隨機(jī)分組的重要性，并且可以在實(shí)踐中學(xué)會(huì)隨機(jī)分組。
參考文獻(xiàn)
[1] National Research Council. 2011. Guidance for the Description of Animal Research in Scientific Publications. Washington, DC: National Academies Press. Available online (http://www.ncbi-nlm.nih.gov/books/NBK84205/)
[2] Festing M F, Altman D G. Guidelines for the Design and Statistical Analysis of Experiments Using Laboratory Animals[J]. Ilar Journal, 2002, 43(4): 244-258.
[3] Michael F. W. Festing. Randomized Block Experimental Designs Can Increase the Power and Reproducibility of Laboratory Animal Experiments[J]. ILAR Journal, 2014.
[4] 趙偉，孫國(guó)志. 常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組方法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，2009年第4期
[5]萬(wàn)霞, 劉建平. 臨床試驗(yàn)中的隨機(jī)分組方法. 中醫(yī)雜志2007 年第48 卷第3 期