激光掃描共聚焦顯徼鏡與圖像半定量分析相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):

1．更精細(xì)、精確度更高。激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)免疫熒光組織化學(xué)染色樣品做定量分析時(shí)，利用激光聚焦和系統(tǒng)軟件分析對(duì)組織進(jìn)行深層掃描，不破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可深層次準(zhǔn)確定位并精確定量。而一般圖像分析只是以熒光灰度的差別變化進(jìn)行半定量分析。

2．激光掃描共聚焦顯微鏡一般有兩個(gè)以上不同波長(zhǎng)的激光管，只要將標(biāo)本標(biāo)記上不同波長(zhǎng)的熒光，就可以在同一張切片上同時(shí)分析兩種或更多不同指標(biāo)的變化，并比較它們之間的比值變化，精確而又方便，這一特點(diǎn)是一般圖像分析無(wú)法比擬的。

3．激光掃描共聚焦顯微鏡可根據(jù)需要提供純熒光、自光以及熒先與臼光合成圖像等多種圖像，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般圖像分析。

4．以往免疫熒光染色多要求冰凍新鮮組織標(biāo)本，用石蠟切片在普通熒光顯微鏡下觀察，常因背景非特異性熒光過(guò)強(qiáng)影響觀察結(jié)果。而石蠟標(biāo)本來(lái)源廣泛，適用于回顧性研究。激光掃描共聚焦顯徼鏡可掃描石蠟切片的熒光染色，可避免因背景非特異性熒光過(guò)強(qiáng)而影響觀察結(jié)果，從而可獲得清晰圖像，這也是激光掃描共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢(shì)所在。

激光掃描共聚焦顯維鏡定量分析的注意事項(xiàng)

一、制備高特異性和高效價(jià)的熒光抗體

標(biāo)本只有在用熒光探針標(biāo)記的前提下才能進(jìn)行共聚焦顯微鏡檢測(cè)．制備高特異性和高效價(jià)的熒光抗體是檢測(cè)的關(guān)鍵。這就要求選用高質(zhì)量的熒光素和高特異性與高效價(jià)的免疫血清。同時(shí)還要對(duì)熒光抗體進(jìn)行質(zhì)量鑒定，主要是進(jìn)行特異性和敏感性鑒定。

二、標(biāo)本制作要求

1．標(biāo)本厚度瞭組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，否則激發(fā)光多數(shù)消耗在標(biāo)本下部，而物鏡觀察的上部不能被充分激發(fā)。

2．載玻片載玻片要光潔，無(wú)自發(fā)熒光;載玻片厚度應(yīng)在0.8~1. 2mm之間，太厚會(huì)吸收較多的光信不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚焦。

3．封固劑﹑甘油必須無(wú)色透明，無(wú)自發(fā)熒光。由于熒光在pH 8. 5~9.5時(shí)較亮，不易很快退去，常用甘油加入0. 5mol / lpH9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液封片。

三、定量研究的要求

1．隨機(jī)性

(1)在感興趣區(qū)域內(nèi)隨機(jī)抽樣，不能主觀地選擇一些便于定量的“理想切片”，這種"理想切片”不能代表所要研究的整體區(qū)域。

(2)在隨機(jī)抽取的切片上，應(yīng)隨機(jī)抽取觀察視野。

(3)在隨機(jī)抽取的視野中，通過(guò)連續(xù)觀察“光學(xué)切片”，得到感興趣結(jié)構(gòu)的三維定量信息。如果不能連續(xù)觀察“光學(xué)切片”，需要在Z軸方向隨機(jī)抽樣，然后作定量研究。

2．避免參照陷阱

如果獲得的資料是密度信息，當(dāng)比較各組參照空間(包含待測(cè)結(jié)構(gòu)的區(qū)域)的體積不同時(shí)，根據(jù)密度信息可能得出錯(cuò)誤結(jié)論。因此，需要注意所謂的參照空間“陷阱”問(wèn)題。