??Western Blot實(shí)驗(yàn)可以說(shuō)是生物專業(yè)最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)了，然而，雖然WB實(shí)驗(yàn)天天做，但是正常高清的結(jié)果圖并不是你想有就能有。

??WB實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)最多問(wèn)題的，應(yīng)該就是各種背景問(wèn)題了。

??你想一下，好不容易實(shí)驗(yàn)過(guò)五關(guān)斬六將做到最后一步，掃描結(jié)果出了，是這樣的：

??這真的是讓人非常郁悶了。

??為什么明明跑出了想要的趨勢(shì)，但就是背景臟?怎么讓自己的條帶不因臟臟的背景而毀了呢?

??這里要清楚一點(diǎn)，背景臟不一定是因?yàn)閮x器不干凈造成的，也有可能是蛋白降解或者整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中條件不合適造成的，有可能是以下的環(huán)節(jié)出了問(wèn)題：

??1、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

??提取蛋白所需的研磨器材，以及制膠的玻璃板、梳子要清洗干凈;

??若長(zhǎng)期不使用，建議器材在實(shí)驗(yàn)前再行清洗一次以杜絕相應(yīng)的污染。

??2、提取蛋白

??選擇合適的蛋白裂解液，充分去除一些干擾因素，比如核酸，多糖，脂類等;

??建議蛋白在測(cè)量濃度后變性分裝保存，避免反復(fù)凍融使蛋白發(fā)生降解;

??注意Loading buffer在保質(zhì)期內(nèi)，蛋白加入Loading buffer后充分混勻，再煮沸變性。

??3、制膠

??玻璃板夾緊之后，有些人習(xí)慣性加水試一下是否漏膠，建議用蒸餾水而不是自來(lái)水測(cè)試，測(cè)試結(jié)束后要將玻璃板之間的水倒干凈，用濾紙吸干殘留的水;

??灌膠之前要將配好的試劑充分混勻，灌膠的過(guò)程中要掌握好速度，緩慢加入，避免產(chǎn)生氣泡；

??灌注好分離膠后，緩緩加入無(wú)水乙醇封膠，該步操作時(shí)速度一定要慢，防止膠面被沖變形;在等待分離膠凝固的過(guò)程中，不要總?cè)u晃觀察；

??溫度較高的情況下，30min左右就會(huì)凝固，冬天氣溫較低可能需要較長(zhǎng)時(shí)間；

??若分離膠液面不平，會(huì)影響后期蛋白電泳的效果。

??4、轉(zhuǎn)膜

??轉(zhuǎn)膜前需在轉(zhuǎn)膜板兩側(cè)各放置3-4張濾紙(兩側(cè)數(shù)量相同)；

??切記不要用手直接接觸PVDF膜和濾紙，手上的油脂會(huì)對(duì)其造成污染，務(wù)必佩戴干凈的手套，全程盡量使用鑷子夾??；

??轉(zhuǎn)膜過(guò)程中海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿每一層的氣泡要排空；

??轉(zhuǎn)膜時(shí)要使整個(gè)電轉(zhuǎn)儀置于冰水混合物中，常用220V或者其他高電壓進(jìn)行；

??機(jī)器溫度升高，會(huì)使蛋白降解，也就是轉(zhuǎn)膜后，用麗春紅染色發(fā)現(xiàn)條帶跑糊，發(fā)光后條帶和背景也會(huì)臟的一塌糊涂。

??5、孵育抗體

??孵育一抗的時(shí)間大多會(huì)選擇4℃過(guò)夜，也可以室溫封閉2小時(shí)，4℃過(guò)夜效果會(huì)比室溫好，4℃過(guò)夜具體多長(zhǎng)時(shí)間算合適，其實(shí)沒(méi)有硬性規(guī)定；

??二抗孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般是室溫下?lián)u床孵育1~2小時(shí)，抗體孵育完成后要清洗干凈，特別是二抗孵育完成后，否則可能導(dǎo)致顯影結(jié)果出現(xiàn)高背景。

??6、發(fā)光液配置

??大部分實(shí)驗(yàn)室使用的ECL發(fā)光液，A液和B液按照1：1的比例配置；

??發(fā)光液要求現(xiàn)用現(xiàn)配，每次根據(jù)使用量合理配置用液量；

??發(fā)光液配置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)同樣會(huì)引起發(fā)光效果不好，背景臟或者漆黑一片。