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實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

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分子實(shí)驗(yàn)

ELISA檢測(cè)

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一、實(shí)驗(yàn)概念

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)寫ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)為免疫學(xué)中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。


二、實(shí)驗(yàn)流程(具體步驟以說明書為準(zhǔn)):

取出ELISA試劑盒→封閉→洗滌→加入一抗→洗滌→加HRP標(biāo)記的二抗→洗滌→底物顯色→加入終止液→酶標(biāo)儀讀數(shù)→數(shù)據(jù)分析


三、樣本要求

樣本形式

處理方式

保存

運(yùn)輸

血清

干燥管(黃色)或促凝管(紅色)收集全血,室溫自然凝固10-20min,離心5-10min(2500-3500rpm/min)。采血過程中應(yīng)避免溶血,仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心

-20℃或更低

冰袋或干冰

血漿

抗凝管(紫色、黑色、綠色)收集全血,采集后馬上混勻,靜置10min左右,離心5-10min(2500-3500rpm/min)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心

-20℃或更低

冰袋或干冰

尿液

用無菌管收集,離心10-20min(2500-3500rpm/min),仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心

-20℃或更低

冰袋或干冰

糞便

用無菌15ml離心管收集, 1g樣本+9ml PBS(0.01M,pH=7.4),充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min),取上清備用

-20℃或更低

冰袋或干冰

胸腹水、腦脊液、肺泡灌洗液

同尿液

-20℃或更低

冰袋或干冰

細(xì)胞

檢測(cè)分泌性的成份:用無菌管收集,5-10min(2500-3500rpm/min),仔細(xì)收集上清

-20℃或更低

冰袋或干冰

 

細(xì)胞內(nèi)指標(biāo):吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基,胰酶消化細(xì)胞,收集細(xì)胞沉淀,PBS(0.01M,PH=7.4)清洗一次,PBS稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到1×107個(gè)/ml左右,充分研磨后超聲裂解(或反復(fù)凍融),以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,離心5-10min(2500-3500rpm/min),取上清備用

 

 

動(dòng)物組織

用無菌15ml離心管收集, 組織重量不能低于50mg,1g組織加入9ml PBS(0.01M,PH=7.4),手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,勻漿過程中,PBS分2次加進(jìn)去,這樣勻漿更充分。充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min)。取上清備用(切勿加入細(xì)胞裂解液)

-20℃或更低

冰袋或干冰

植物組織

用無菌15ml離心管收集, 組織重量不能低于50mg,1g組織加入9ml PBS(0.01M,PH=7.4),手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,勻漿過程中,PBS分2次加進(jìn)去,這樣勻漿更充分。充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min)。取上清備用(切勿加入細(xì)胞裂解液)

-20℃或更低

冰袋或干冰

牛奶

8000轉(zhuǎn)高速離心,離心后分三層,第一層是脂肪層,中間層是乳清,底層是固態(tài)蛋白,取中間層保存?zhèn)溆?。乳清量參照血清量。

-20℃或更低

冰袋或干冰

注意事項(xiàng):
     1.避免反復(fù)凍融,樣本處理之后可分裝密封保存。4度保存應(yīng)小于1周,-20度不超過3個(gè)月,-80度不超過12個(gè)月。在標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫,不應(yīng)加熱使之融解。
     2.不能檢測(cè)含 NaN3 的樣品,因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性,從而導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。

血常規(guī)樣本為EDTA-K2抗凝的全血樣本,抗凝管紫色頭蓋管,收集混勻不能凝血,樣本量不能少于0.2ml。當(dāng)天檢測(cè),此檢測(cè)為全套結(jié)果,不單獨(dú)檢測(cè)某一項(xiàng)或者幾項(xiàng)。
     凝血四項(xiàng)(凝血功能):包括凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB) 常見的凝血4指標(biāo)。樣本為枸櫞酸鈉抗凝的全血樣本。
     以上兩種樣本采集樣本后需要在24h內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn);
     樣本保存溫度為常溫,如果室溫超過37℃,需要低溫2-8℃保存運(yùn)輸。


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