分子實(shí)驗(yàn)
ELISA檢測(cè)
一、實(shí)驗(yàn)概念
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)寫ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)為免疫學(xué)中的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)。
二、實(shí)驗(yàn)流程(具體步驟以說明書為準(zhǔn)):
取出ELISA試劑盒→封閉→洗滌→加入一抗→洗滌→加HRP標(biāo)記的二抗→洗滌→底物顯色→加入終止液→酶標(biāo)儀讀數(shù)→數(shù)據(jù)分析
三、樣本要求
樣本形式 | 處理方式 | 保存 | 運(yùn)輸 |
血清 | 干燥管(黃色)或促凝管(紅色)收集全血,室溫自然凝固10-20min,離心5-10min(2500-3500rpm/min)。采血過程中應(yīng)避免溶血,仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心 | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
血漿 | 抗凝管(紫色、黑色、綠色)收集全血,采集后馬上混勻,靜置10min左右,離心5-10min(2500-3500rpm/min)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心 | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
尿液 | 用無菌管收集,離心10-20min(2500-3500rpm/min),仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心 | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
糞便 | 用無菌15ml離心管收集, 1g樣本+9ml PBS(0.01M,pH=7.4),充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min),取上清備用 | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
胸腹水、腦脊液、肺泡灌洗液 | 同尿液 | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
細(xì)胞 | 檢測(cè)分泌性的成份:用無菌管收集,5-10min(2500-3500rpm/min),仔細(xì)收集上清 | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
| 細(xì)胞內(nèi)指標(biāo):吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基,胰酶消化細(xì)胞,收集細(xì)胞沉淀,PBS(0.01M,PH=7.4)清洗一次,PBS稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到1×107個(gè)/ml左右,充分研磨后超聲裂解(或反復(fù)凍融),以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,離心5-10min(2500-3500rpm/min),取上清備用 |
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動(dòng)物組織 | 用無菌15ml離心管收集, 組織重量不能低于50mg,1g組織加入9ml PBS(0.01M,PH=7.4),手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,勻漿過程中,PBS分2次加進(jìn)去,這樣勻漿更充分。充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min)。取上清備用(切勿加入細(xì)胞裂解液) | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
植物組織 | 用無菌15ml離心管收集, 組織重量不能低于50mg,1g組織加入9ml PBS(0.01M,PH=7.4),手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,勻漿過程中,PBS分2次加進(jìn)去,這樣勻漿更充分。充分勻漿完離心5-10min(2500-3500rpm/min)。取上清備用(切勿加入細(xì)胞裂解液) | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
牛奶 | 8000轉(zhuǎn)高速離心,離心后分三層,第一層是脂肪層,中間層是乳清,底層是固態(tài)蛋白,取中間層保存?zhèn)溆?。乳清量參照血清量。 | -20℃或更低 | 冰袋或干冰 |
注意事項(xiàng): | |||
血常規(guī)樣本為EDTA-K2抗凝的全血樣本,抗凝管紫色頭蓋管,收集混勻不能凝血,樣本量不能少于0.2ml。當(dāng)天檢測(cè),此檢測(cè)為全套結(jié)果,不單獨(dú)檢測(cè)某一項(xiàng)或者幾項(xiàng)。 |