分子實驗
熒光定量PCR（QPCR）
一、實驗概念
RT-PCR即逆轉錄pcr,其原理是提取組織或細胞中的總RNA，利用Oligo(dt)或隨機引物反轉錄，獲得cDNA模板，進一步通過PCR反應獲得目的基因產(chǎn)物或檢測其表達水平。與其他技術相比，RT-PCR技術更加靈敏易于操作，在細胞/組織基因表達水平的半定量檢測，特定基因cDNA克隆及RNA病毒檢測等分子生物學領域得到廣泛應用。
二、實驗流程
樣本接收→引物合成→提取總RNA→RNA濃度測定→逆轉錄成cdna→熒光定量PCR→數(shù)據(jù)分析
三、注意事項
1.普通PCR及realtime PCR樣本 注意事項 | ||||
樣本形式 | 處理方式 | 保存 | 運輸 | 可檢測指標數(shù) |
新鮮組織 | 1、 0.1g新鮮組織(至少) | 液氮或-80℃ | 干冰 | 3-5個 |
| 2、 加入1ml的Trizol（可選） |
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細胞 | 1、 培養(yǎng)基吸出棄掉，用PBS洗滌兩次后，吸棄PBS。 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 2-3個 |
| 2、 每1*10^6個細胞加1ml TRIzol，細胞刮板掛或吹打使細胞脫落，吹至拉絲狀，收集之后凍存?zhèn)溆谩?/p> |
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全血 | 1、大于等于2ml全血加入EDTA或肝素抗凝。 | 4℃ | 冰袋 | 3-5個 |
| 2、4h內(nèi)進行淋巴細胞分離 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 詢問 |
體液 | 1. 12000rpm/min離心10-20min，取沉淀 | 液氮或-80℃ | 干冰 | 詢問 |
1.組織在1-2min內(nèi)完成取材，速凍，，并立即放入-80℃或液氮中保存。 | ||||
四、實驗結果
擴增完畢后，進入結果分析界面，看CT值、起始拷貝數(shù)、標準偏差等，如果是SYBR做的話，再看下溶解曲線。以β-actin為內(nèi)參照基因，與對照組相比，得到目的基因表達的相對定量值（RQ值），將RQ值用于統(tǒng)計分析。